Revolucionando Medicina con Anticuerpos Monoclonales: _{El trabajo de César Milstein}

Veneno de serpiente como una inspiración

Nacido el 8 de Octubre del año 1927 en Bahía Blanca, Argentina, Cesar Milstein era el hermano de en medio de tres hermanos en una familia de inmigrantes Judíos del Este de Europa. Su padre, Lázaro llegó de una aldea en el Ucrania; su madre Máxima nació en tierra Argentina pero ella en si era hija de Judíos Ucranios. Como muchos Judíos del Este de Europa en ese entonces, los padres de Milstein se identificaban como Judíos en el sentido cultural y no solamente en el sentido religioso. Leían literatura Yidis y se asociaban socialmente con otros Judíos, los cuales incluía trabajar en organizaciones Judías no religiosas. Eran parte de movimientos socialistas, concernientes de derechos de trabajadores y no visitaban sinagogas y no miraban al mundo de una perspectiva religiosa. También hablaban Yidis entre si en el hogar, pero criaron a sus hijos a hablar solamente en Español.

De niño, Milstein amaba leer libros y se fascinaba con la ciencia a la edad de ocho años debido a una conversación con un primo mayor. El primo trabajo en el Instituto Malbran como un bioquímico y durante su conversación, ella explicó a un joven Cesar como desarrollaba un suero para tratamiento para victimas de mordidas de serpiente. Esto fue el comienzo de la fascinación de Milstein con el sistema inmune y tuvo un impacto grande en su trabajo subsiguiente. En ese entonces, científicos no conocían el mecanismo que hacia funcionar el antisuero del veneno de una serpiente. Pero luego, Milstein aprendió que el sistema inmune produce anticuerpos, proteínas que le dan al antisuero su efecto benéfico contra las toxinas que la gente recibe en una mordida de serpiente.

Un año después de la conversación con su primo acerca del suero de serpiente, Milstein leyó la traducción en español de Microbe Hunters (Cazadores de Microbios) por Paul de Kruif. El libro describe a Antony van Leeuwenhoek, Louis Pasteur y a otros pioneros de la biología como aventureros. Eso llevo a Milstein mas hacia el mundo de la ciencia de la vida. Fue en ese entonces que sabia que quería una carrera biológica.

Un estudiante y activista en Buenos Aires

Milstein se mudo a la capital de Argentina, Buenos Aires para su educación secundaria. En el año 1945, entro a la Universidad de Buenos Aires para estudiar química. Era un estudiante brillante, pero la política y el escasez de fondos lo obligaron pensar en otras cosas a parte de sus estudios. Su crianza Judía, secular y liberal era la base de su identidad y su interés en la ciencia no reemplazo eso, pero si le agregó. Como estudiante de pregrado, se gravitó naturalmente hacia movimientos políticos contra el gobierno de Perón en Argentina, este gobierno era de la derecha política económicamente y generalmente no apoyaban investigación científica en la universidad. Aparte de eso, el gobierno derechista era complejo cuando se trataba de relaciones con la comunidad Judía del país. El fundador del partido derechista, Juan Perón, simpatizaba con las Potencias del Eje de la Segunda Guerra Mundial y los Nazis huyendo de Europa se les permitió refugió en Argentina. Por otra parte, Perón habló a favor de los derechos de los Judíos y estableció relaciones diplomáticas con Israel en el año 1949, y había un numero notable de Peronistas Judíos. Pero la familia Judía de Milstein eran socialistas. Fueron criados para creer que la escasez de riqueza no debe impedir los beneficios de la civilización, especialmente en la educación.

Las políticas derechistas de Perón enojaron a la mayoría de los estudiantes debido a que ponían restricciones en universidades y vida estudiantes y buscaban privatizar la educación. La Privatización significaría que solamente estudiantes de familias ricas podrían asistir a la universidad. Milstein era popular en el campus debido a que se alineaba con las manifestaciones izquierdistas que favorecían educación gratis y en el año 1951 terminó siendo presidente de la unión estudiantil. Fue un gran riesgo para Milstein debido a que lideres estudiantiles estaban siendo arrestados y se esperaba que el presidente de la unión estudiantil ayudara. El arresto mas famoso era el de Ernesto Mario Bravo. Igual que Milstein, Bravo era un estudiante de química. El 17 de Mayo del año 1951, Bravo fue secuestrado por la policía (no arrestad) y torturado por el gobierno durante los próximos 20 días. Estudiantes y administradores de la universidad protestaron, demandando el retorno de Bravo, y las protestas culminaron en una huelga universitaria que duró dos días. Como presidente de la unión estudiantil, Milstein estaba siempre en el punto de mira del gobierno pero las protestas y la huelga culminaron a la liberación de Bravo.

Junto con políticas intensas en el campus, los años de pregrado de Milstein fueron difíciles debido a un accidente que tuvo en un lago al tirarse y golpearse con un tronco. Para recuperarse, tuvo que tomar tiempo libre. Al regresar a sus estudios, se cayó se enamoró de Celia Prilleltensky, otra estudiante de química. Los dos se graduaron en el año 1951 y se casaron un año después. Para ese entonces, Milstein se matriculó como un estudiante de postgrado en la misma universidad y encontró un mentor, el Profesor Andrés Stoppani, para guiarlo por el programa PhD en la bioquímica. Cuando comenzó el programa de doctorado en 1951, Milstein se sorprendió y también estaba desilusionado en aprender que tan poco financiamiento Stoppani y su laboratorio tenían. Igual que los problemas que Milstein había tenido durante su pregrado, el poco financiamiento a la investigación era un resultado de las políticas derechista de Perón. Stoppani sospechaba que la perspectiva política de Milstein y su historia haciendo campaña contra la política educativa de Perón podría meterlo en problema. Stoppani le aconsejo a Milstein a que se tomara un poco de tiempo libre con su esposa hasta que el ambiente político cambiara.

En el año 1954, la situación política se había calmado lo suficiente para que Milstein empezara a trabajar con Stoppani. En ese entonces, Stoppani aun no tenia financiamiento para apoyar el estudiante de posgrado. Fue forzado a utilizar una porción de su bajo salario para adquirir materiales para experimentos y no podía costearse el equipo necesario. Milstein trabajó en investigaciones de enzimas en el laboratorio Stoppani para su disertación. Sin embargo para apoyar sus estudios, tuvo que trabajar tiempo medio en un laboratorio privado de bioquímica clínica. Fue hasta 1955 que el financiamiento del gobierno mejoró lo suficiente para el departamento de bioquímica para comprar equipo básico, tal como una centrifuga refrigerada, pero otras maquinas esenciales aun estaban fuera del alcance. Para utilizar una maquina particularmente importante – un espectrómetro – Milstein tuvo que caminar varias cuadras entre edificios. Esto utilizo bastante tiempo útil y un día también le causo quebrar equipo de vidrio, el cual casi hace que lo expulsen del departamento.

La devoción de Milstein a la política en el campus como estudiante de pregrado y la escasez de fondos que plagó su vida diaria como estudiante de posgrado le quito de su tiempo con sus estudios. Sin embargo, se desempeño brillantemente como estudiante. En el año 1957, obtuvo su doctorado basado en investigaciones concerniendo el tipo de enlaces químicos en enzimas llamado un puente disulfuro. Junto con obtener su PhD, la investigación del puente disulfuro le obtuvo un premio de la Asociación Química Argentina por la mejor tesos. Desde ese entonces, continuó trabajando con Stoppani y los dos publicaron artículos científicos innovadores resultaron del trabajo doctoral de Milstein.

Avances Profesionales, pero mas dificultades políticas

En 1958, Milstein se mudó a Cambridge, Inglaterra para continuar su investigación con el Sir William Dunn School of Biochemistry, apoyado una beca universitaria del Consejo Británica. Dentro de un par de años, esto llevo a Milstein a ser otorgado un segundo doctorado. Este era de la Universidad de Cambridge, basándose en su investigación de una enzima llamada fosfoglucomutasa - investigación que reveló un mecanismo bien inesperado por la cual la enzima se activo. Durante este periodo, Milstein también conoció y formo enlaces profesionales con el bioquímico famoso Fred Sanger, ganador del Premio Nobel de 1958. Pronto, Milstein y Sanger comenzaron a trabajar juntos en la enzima fosfoglucomutasa. En el año 1960, el par publicó un articulo revelando la secuencia de amino ácidos (bloques de construcción) que construían una región importante de la enzima.

En el año 1961, Milstein regreso a Argentina en donde se hizo el encargado del nuevo Departamento de Biología Molecular en el Instituto Malbran, el mismo centro de investigación en donde su primo mayor había trabajado en el antisuero de serpiente. Su esposa Celia también había sido contratada para su nuevo departamento. Era un tiempo de reforma, con muchos otros científicos regresando a Argentina junto con los Milsteins, debido a que el gobierno de Perón había sido decaído. Adicionalmente a seguir su investigación de fosfoglucomutasa, Milstein empezó a estudiar otra enzima, fosfatasa alcalina. Sin embargo, muy pronto, el nuevo gobierno fue derrocado por un golpe de estado. Esto puso en lugar a otro gobierno derechista, uno que era hostil a Milstein debido a que era un académico con un nombre Judío, el cual en las mentes de autoridades era un sospechoso de ser comunista. Entonces junto con otros miles de científicos y académicos, Milstein se fue de Argentina una vez mas para regresar a Cambridge.

Investigaciones de anticuerpos

Milstein pudo regresar a Cambridge rápidamente debido a que su amigo y colega Fred Sanger, quien dirigió la división de química de proteínas del Laboratorio de Investigación de Biología Molecular (LMB). El enfoque de Milstein en el LMB era la formación de moléculas de anticuerpos, trabajando en el mismo tema que lo había inspirado cuando era niño.

Científicos sabían de anticuerpos desde finales del siglo XIX. Sabían que los anticuerpos protegían contra enfermedades, pero no sabían como funcionaban esos anticuerpos. Cuando Milstein comenzó sus investigaciones en LMB en la década de 1960, científicos sabían que los anticuerpos eran proteínas. Sabían que los anticuerpos tenían la forma casi de la letrea Y y que esta forma tenia algo que ver con como funcionaban los anticuerpos. La parte superior de la Y se sabia que variaba enormemente entre anticuerpos. Esta variabilidad permite el sistema inmune producir anticuerpos capaces de agarrarse a una gran variedad de moléculas extrañas al organismo. La parte superior de la forma de la Y agarra a una molécula particular extraña de la misma manera que un candado se conecta perfectamente con la forma de la llave que le combina. Científicos en la década de 1960 sabían que anticuerpos trabajaban de esta manera, pero como tantas diferentes formas podían ser producidas era un misterio.

Para resolver el misterio, Milstein diseñó experimentos para probar la posibilidad de que la diversidad podría ser resultado de mutaciones que ocurren el secuencias de ADN. Esta hipótesis se desarrollo basada en una idea anterior simple que fue propuesta en el año 1959 por otro biólogo molecular pionero, Joshua Lederberg. Milstein no hablaba de este tipo de mutaciones que son pasadas a generaciones futuras. En vez de esto, el se refería a mutaciones somáticas, cambios en secuencias genéticas en el ADN de células de cuerpo, las cuales son las células aparte de la células reproductivas (llamadas gametos). Estas mutaciones que no son pasadas a la siguiente generación, pero ahora son importantes debido a que a menudo resultan en cáncer. Particularmente, Milstein se propuso investigar mutaciones somáticas en el sistema inmune que hacen los anticuerpos.

Abordar problemas de investigación

Durante la década de 1960, numerosos científicos estudiaban el ADN de las células del sistema inmune y todos, incluso Milstein, se encontraban con los mismos dos problemas. Primero, experimentos requeridos un gran numero de células y células que habían hecho anticuerpos eran difíciles de aislar. Segundo, la investigación requería averiguar como el ADN en una célula que formaban un tipo de anticuerpo era diferente que el ADN de una célula que formaba otro diferente anticuerpo. Todas las personas tienen miles de millones de células inmunes que producen anticuerpos en su cuerpo. Cada células se dedica a hacer un anticuerpo especifico se llama un clon. Para compara un clon con otro, Milstein sabia que necesitaría múltiples copias de cada clon.

Para poder superar ambos problemas, Milstein investigó proteínas Bence-Jones, las cuales son producidas pro un tipo de cáncer llamado mieloma múltiple. Anticuerpos consisten de pequeñas unidades que forman la parte superior de la Y llamadas cadenas pesadas y cadenas livianas. Desde que proteínas Bence-Jones parecen tener la misma estructura como una sección de las cadenas livianas de anticuerpos, eso soluciono el problema de aislar anticuerpos. Las proteínas Bence-Jones podrían también ser obtenidas en grandes cantidades de la orina y sangre de múltiples pacientes de mieloma, resolviendo el problema de adquirir grandes cantidades de células. Además, proteínas Bence-Jones del mismo paciente se sabia que eran idénticas una a la otra. Esencialmente mieloma múltiple hace que un montón del mismo clon de célula inmune y un pedazo de ese anticuerpo, la cadena liviana, se acumule en la sangre y orina de la persona.

Al utilizar proteínas Bence-Jones de muestras de pacientes, Milstein creía que podía averiguar mas rápidamente que otros científicos como anticuerpos trabajaban y como se formaban. La esperanza era que lo llevarían a diseñar experimentos para probar su hipótesis de mutación somática que la diversidad de formas de anticuerpos es el resultado de mutaciones en secuencias de ADN. Como las enzimas de proteínas que estudió Milstein, anticuerpos y proteínas de Bence-Jones son hechas de aminoácidos. La secuencia de aminoácidos de cada proteína depende en la secuencia de ADN, o genes, disponibles en cada célula. La táctica a largo plazo de Milstein era comparar la secuencia de ADN y aminoácidos con la estructura de proteína Bence-Jones. Si el podía hacer esto, podría probar que la diversidad de anticuerpos de hecho si viene de mutaciones somáticas.

En el año 1962, Michael Potter, un biólogo molecular del Instituto Nacional de Cáncer de EEUU (NCI), descubrió accidentalmente que cierta cepa de ratones de laboratorio (ratones BALB/c) crece células de mieloma si son inyectadas con aceite mineral. Esto hace que múltiples células de mieloma y proteínas Bence-Jones sean mas fácil de obtener comparado a obtenerlos de las muestras de sangre y orina de voluntarios humanos. Potter y los científicos trabajando con el en NCI empezaron a crecer grandes cantidades de células de mieloma y las hizo disponibles a científicos alrededor del mundo. Durante la década de 1970, un equipo del Instituto Salk de San Diego desarrollo una manera para crecer las células de Potter en cultura de tejido, esto significaba de que grandes cantidades de células podrían ser crecidas sin ni siquiera utilizar ratones. Una línea de estas células llamada MOPC21 y les dio a científicos como Milstein la libertad de enfocar su tiempo y atención en hacer experimentos creativos en vez de dedicar tanto de su tiempo en cuidar las células y mantenerlas vivas en ratos. Milstein colaboro con el patólogo George Browniee para extraer una molécula llamada ARN de células MOPC21. El ARN se produce de ADN y actúa como un intermediario en la construcción de la proteína, incluyendo un anticuerpo, de las bases de aminoácidos. Entonces, al examinar el ARN de células, la secuencia genética de anticuerpos hechas por la célula podría ser obtenida.

Buscando mutaciones

A principios de la década de 1970, Milstein también comenzó a trabajar con dos científicos mas jóvenes llamados David Secher y Dick Cotton. La investigación que tomo forma consistía de dos componentes principales. El primero era clonar las células MOPC21 para reproducir numerosas copias genéticas exactas de la línea celular. Estos ocupaban crecer en una substancia llamada “agar blanda” debido a que esto permitiría a clones individuales a se puedan muestrear fácilmente.

El equipo necesitaba determinar la taza en la cual ocurren mutaciones una vez que los clones crecían consistentemente. Clones que eran mutados de un clon padre – llamados variantes podían ser jalados del agar, y los efectos en los anticuerpos hechos por las células podían ser comparados. Pero después de tres meses de culturizar y analizar anticuerpos de 7,000 clones, solamente cinco variantes en estructura de anticuerpo fue observada. El método era muy lento, aunque la ocurrencia de cualquier mutación era un buen encuentro.

Un nuevo tipo de célula: Hibridomas

El segundo componente de la investigación buscó fusionar dos células de diferentes líneas celulares de mieloma. Este proyecto dependía bastante en las habilidades de Dick Cotton en el laboratorio, quien era un científico post-doctoral visitando desde Australia el laboratorio de Milstein en LMB. Todas las células tenían una mezcla de genes, la mitad de la madre del individuo y la otra mitad del padre. Sin embargo, para la década de 1970, científicos sabían que célula utilizada que producía anticuerpos solamente utilizaba uno de los dos conjuntos de genes parentales para hacer un anticuerpo. Se utilizaban los genes maternales o los paternales, mientras que el otro conjunto de genes se apagaba.

Cotton quería entender porque este era el caso y junto con Milstein decidió que fusionar dos células en una podía revelar algo acerca de que genes ese enciende o se apaga en diferentes situaciones. En la fusión resultante de células hibridas, querían ver cuales genes podrían apagarse y cuales podrían encenderse. También querían saber cuales efectos tenían en la estructura de la célula hecha por la célula hibrida si se apagaran o se encendían los genes de la célula fusionada.

Para que una célula madre haga una célula hibrida, utilizan un mutante crecido de un ratón de la línea celular MOPC21, mientras que la otra célula madre fue era de una línea desarrollada por un investigador Belga. Pero en vez de mostrar que genes de un padre o madre se habían apagado y genes del otro se habían encendido, la célula hecha por la fusión de células de ratón y células de rata hizo algo sorprendente. Se fabricaron anticuerpos utilizando genes de ambas células. A diferencia de células inmunes convencionales, la nueva célula hibrida, la cual llamaban hibridoma, no barajeaba los genes para diferentes regiones de anticuerpos para hacer nuevos tipos de anticuerpos. En vez de esto, decidieron de que la barajeada de genes debe ocurrir temprano en el desarrollo de una célula inmune antes de que la célula comience a fabricar anticuerpos.

Utilizando la misma técnica, pero cambiando un poco los procedimientos para perfeccionarla, el equipo hizo otro tipo de hibridomas de rata con ratón y también hibridomas de ratón con ratón. Los resultados fueron el mismo como en la primera hibridoma: genes de anticuerpo de ambos padres fueron utilizados para fabricar anticuerpos. Sin embargo había un problema. Las nuevas hibridomas revelaron mucho acerca de la genética de producción de anticuerpos, pero no había ninguna manera de controlar cual anticuerpo era producido. En la fisiología normal, el sistema inmune produce anticuerpos que específicamente reconocen y detienen con una entidad externa particular llamada un antígeno. Debido a que hibridomas fueron producidos de células de mieloma, los anticuerpos que fueron producidos eran los mismos anticuerpos en la cual las células de mieloma nacieron para producir como células de cáncer. Milstein necesitaba una manera de provocar los hibridomas para realizar nuevos anticuerpos, lo que significa que anticuerpos contra un antígeno particular, igual que hace el sistema inmune. También los hibridomas viven poco, lo cual hace que experimentos cortos con el paso del tiempo.

Mientras presentaban un articulo en Basel, Suiza, Milstein conoció otro investigador: Georges Köhler había trabajado en su propio tipo de células de fusión utilizando linfocitos B. También llamados células-B, estas son células del sistema inmune que normalmente producen anticuerpos en respuesta a una infección. Cuando eso sucede, se les llama células de plasma; cuando la plasma se hace cancerosa se hacen mieloma múltiple, el tipo de células que Milstein estaba fusionando en hibridomas. Una nueva colaboración desarrollada como un resultado de esta reunión y después de muchos experimentos Milstein y sus colegas crearon un nuevo tipo de hibridoma: una fusión de una célula-B humana saludable y una célula de mieloma de ratón. Realizaron esto a través de un proceso de prueba y error probando diferentes combinaciones de células y observando las diferentes resultantes hibridomas podrían hacer. La hibridoma de célula-B humana y una célula mieloma de ratón resultó ser un logro innovador. Podía manufacturar el anticuerpo que normalmente podía ser hecho por su padre de célula-B, pero de alguna manera fusionar con la célula mieloma de ratón la hizo inmortal. Esto significaba que una hibridoma podía ser utilizada para generar una línea celular que podía existir por largos periodos de tiempo y podía ser utilizados para producir el anticuerpo de la célula inmune en cantidades grandes.

Este logro permitió que Milstein, Kohler y un número creciente de colegas científicos tomaran el siguiente paso: hacer una hibridoma que segregue anticuerpos contra un antígeno seleccionado. Si pudiesen hacer esto, significaría que al utilizar un procedimiento común, anticuerpos podrían reconocer y enlazar virtualmente cualquier cosa seleccionada como antígeno El sistema inmune de ratones reaccionaba fuertemente a glóbulos rojos de ovejas (GRO), lo que significa que ratones fácilmente producen anticuerpos contra GRO. Adicionalmente anticuerpos contra GRO podían ser detectados fácilmente en pruebas de laboratorios utilizados rutinariamente en la década de 1970. Por estas razones, el equipo seleccionó GRO para el antígeno prueba. La meta era crear una hibridoma linfocito-mieloma que fabricaba anticuerpos contra GRO.

En enero del año 1975, el proyecto tuvo éxito al crear células de hibridomas que no solo producían anticuerpos contra GRO pero también los producía en cantidades grandes. En su articulo científico de 1975 publicado en la revista Nature, Milstein y Kohler enfatizaron la importancia de su acontecimiento discutiendo aplicaciones potenciales para la tecnología de anticuerpos de hibridoma en la industria y la medicina. Anticuerpos producidos de esta manera se les llama anticuerpos monoclonales debido a que reconocen un antígeno (de hecho reconocen una parte de un antígeno especifico llamado epítopo. Esto es en contraste a anticuerpos policlonales, los cuales son producidos naturalmente en el sistema inmune cuando es estimulado por la exposición a antígenos. En el caso de respuesta inmune policlonal, los anticuerpos producidos varían en términos de forma física y características para enlazar antígenos. En contraste, anticuerpos monoclonales son todos exactamente los mismos y reconocen la misma molécula y la parte exacta de una molécula.

Anticuerpos monoclonales revolucionan el cuidado de salud

Debido a la especificidad de anticuerpos monoclonales y la gran cantidad de ellos que pueden ser fabricados con una hibridoma, pueden ser utilizados como detectores en medicina y biología. Por ende, durante la década de 1980 y 1990, revolucionaron el cuidado de salud, la industria farmacéutica y la investigación biológica. Virtualmente todas las pruebas para algo biológico, como una prueba sanguínea para el VIH (el virus que causa SIDA), hepatitis, influenza, entre otro. dependen en algún tipo de anticuerpo monoclonal, fabricado con las técnicas desarrolladas por Milstein y sus colegas. Anticuerpos producidos de esta manera también son utilizados para agentes infecciosos en el sector de salud publica, para detección de defensas contra armas biológicas y han sido estudiadas para ser utilizadas para la detección de vida en Marte y en otros planetas. También son utilizados mas y mas frecuentemente en terapias contra enfermedades, incluyendo la Ebola.

Aunque quizás no realizaron que tan lejos en el futuro el trabajo de Milstein podía llevar a la medicina, la comunidad científica entendió la importancia del descubrimiento muy temprano. Entonces, en el año 1984, junto con Köhler y otro colega, Milstein fue otorgado el Premio Nobel en Fisiología y Medicina.