Un Experimento Elegante para Probar el Proceso de Replicación del ADN: _{El trabajo de Meselsohn y Stahl}

Replicación de ADN

Después del descubrimiento del ADN como el material genético (vea ADN I), el nuevo campo de biología molecular se enfocó atentamente en como funciona el ADN. Una de las características mas importantes del ADN es la habilidad de ser copiado con exactitud. Cuando una célula, ya sea de levadura, de bacteria o una célula humana, se divide en dos, ambas células resultantes son genéticamente idénticas entre si y a la célula madre original. Por ende, antes de la división, la célula de alguna manera tiene que copiar todo su ADN para que ambas células resultantes tengan el complemento completo de material genético. De hecho, los científicos como Edwin Chargaff y otros han observado que la cantidad de ADN en una célula se multiplica por dos antes de la división celular. El grupo de ADN después se divide en partes iguales entre las dos células hijas, para que ambas tengan la misma cantidad de ADN como la cantidad que tenía la célula madre original. ¿Pero como exactamente es que esta multiplicación de ADN sucede fue el primer misterio y los científicos comenzaron a proponer varios mecanismos posibles o "modelos" de la replicación de ADN?

Siguiendo la propuesta y eventualmente la aceptación del modelo Watson-Crick de la estructura del ADN, biólogos moleculares creían de que cada hebra de ADN servía de una manera como una plantilla de copia para la síntesis de una nueva molécula de ADN (vea nuestro ADN II para mas información). Sin embargo, siguieron existiendo algunos acertijos. Lo mas importante es que los científicos tuvieron dificultad imaginándose como dos hebras de ADN que son inmensamente largas e interlazadas entre sí podían separarse sin resultar en algo rompiéndose o enrollarse demasiado. Adicionalmente, científicos se preguntaban como las dos hebras podían separarse dado el gran número de enlaces de hidrógeno que los mantiene juntos. Algunos visionaron la replicación sucediendo en pequeños momentos, mientras que otros se lo imaginaban un proceso continuo como una cremallera. Esta paradoja también causó a algunos científicos prominentes de ese entonces que dudaran por completo la estructura de doble hélice del ADN. Sin embargo, estudiantes comenzaron a trabajar en posibles soluciones teoréticas a la separación de dos hebras de ADN interlazadas y al final de la década de 1950, tres modelos hipotéticos para la síntesis de ADN habían sido debatidos: el modelo conservativo, el modelo semi-conservativo y el modelo dispersivo. La Figura 1 a continuación provee un diagrama de cada uno de estos mecanismos.

Brevemente declarado, el modelo conservativo de la replicación de ADN mantiene que cuando el ADN es replicado antes de la división celular, una de las dobles hebras reciben todas las replicaciones nuevas de ADN en ambas hebras, mientras que la otra recibe solamente las dos hebras originales de ADN en la célula madre. Sin embargo, el modelo semi-conservativo (también llamado "modelo de cremallera" por James Watson), mantiene de que las dos hebras originales de ADN se separan y las dos moléculas hijas consisten en una hebra "vieja" de ADN de la célula madre y una hebra nueva. Finalmente, el modelo dispersivo mantiene de que el ADN es copiado en pequeños momentos y que ambas hebras hijas de ADN reciben una mezcla del ADN original y el nuevo ADN. Cada uno de estos tres posibles modelos han sido propuestos por diferentes científicos y cada uno tenía ciertas ventajas en explicar la separación del ADN patrón interlazado. Sin embargo, la evidencia para desprivar o apoyar cualquiera de estos modelos eran escasos.

Ésto cambió cuando Matthew Meselson y Franklin Stahl, dos científicos trabajando en el Instituto de Tecnología de California (CalTech), construyeron un experimento ingenuo que probó todos los tres modelos al mismo tiempo. Para entender como este experimento funciona es importante recordar como isótopos se comportan. Aunque un isótopo pesado de un átomo dado se comporta en una manera completamente normal en reacciones químicas, la presencia de uno (o mas) neutrones adicionales le da al átomo una masa atómica un poco mas grande. Como resultado, las moléculas que contienen estos isótopos son mas densas. Esta pequeña diferencia en densidad permite a los científicos que separen las moléculas físicamente con diferentes isótopos basadas en la diferencia de su densidad.

Para su experimento, Meselson y Stahl utilizaron una forma especial de nitrógeno: ¹⁵N. Normalmente, casi todo el nitrógeno en cualquier célula es ¹⁴N y por ende contiene siete neutrones adicionales a los siete protones. Entonces ¹⁵N, con ocho neutrones es considerado "nitrógeno pesado" (pero no es radioactivo). Cuando células en crecimiento son alimentadas con nitrógeno pesado, el isótopo ¹⁵N entra al metabolismo de la célula y cantidades significantes del mismo serán incorporadas a los nucleótidos ricos en nitrógeno y en ADN. Por ende las células de ADN cultivadas con ¹⁵N es su fuente alimenticia serían mas densas que células normales. El poder de tener ADN de diferentes densidades es que pueden ser separadas por centrifugación.

Para este proceso, células fueron abiertas primero, después de eso el contenido celular (llamado el "extracto crudo") fueron mezclados con una solución de sal cloruro de cesio y puestos en un tubo de centrífuga con cuarzo transparente que permitió que la solución fuese fotografiada mientras daba vueltas. La célula después fue dada vuelta en el tubo a velocidades muy altas por muchas horas y los iones con mucho cesio fueron jalados hacia abajo de la célula por fuerza centrífuga. Eventualmente el equilibrio se alcanzó y un "gradiente de densidad" fue establecido en la célula con la parte de abajo conteniendo la concentración mas alta de cesio y la parte de arriba del tubo conteniendo la concentración mas baja. Adentro de un gradiente de densidad como este, todas las moléculas de un extracto de célula incluyendo el ADN "flotarán" o se "hundirán", migrando al lugar en el gradiente que corresponde a su densidad. Las moléculas mas densas fueron jaladas hacia la parte de abajo de una célula, mientras que las moléculas mas livianas se mantienen mas arriba en la célula, como se puede ver en la Figura 2.

Antes de comenzar su análisis de replicación de ADN, Meselson y Stahl primero mostraron de que el ADN que consiste de ¹⁴N puede ser separado del ADN que contiene ¹⁵N. Alcanzaron esto al cultivar dos grupos separados de bacteria de Escherichia coli, alimentando a cada grupo un isótopo de nitrógeno diferente. Después, abrieron las células bacteriales mezcladas con extractos de ambos grupos en una célula centrífuga y le dieron vuelta para establecer el gradiente de densidad. Para detectar el ADN, lo alumbraron con luz ultravioleta (UV) en la centrífuga en movimiento debido a que el ADN absorbe luz UV y por ende forma una sombra durante la exposición a película fotográfica.

Después, Meselson y Stahl realizaron algo interesante. Criaron un gran grupo de bacteria en nitrógeno pesado (¹⁵N) y después cambiaron la bacteria a una dieta que contenía solamente nitrógeno regular (¹⁴N). Esto les permitió distinguir entre el ADN pre-existente de las células paternales y ADN recién sintetizado, debido a que todas las hebras recién sintetizadas contenían ¹⁴N y son menos densas. Utilizaron este arreglo experimental para poner a prueba los tres posibles modelos de replicación de ADN.

Como todas las hipótesis científicas propias, cada uno de los tres modelos de replicación de ADN hace ciertas predicciones y la comprobación de predicciones hipotéticas es una parte clave de la investigación científica. En el caso del experimento de Meselson y Stahl, las predicciones que hace cada uno de estos modelos son los siguientes. Si el modelo conservativo de la replicación de ADN es verdadero, entonces uno predicaría de que las células bacteriales cultivadas para una generación (20 minutos) con ¹⁴N tuvieran dos diferentes tipos de ADN: el ADN original sería la densidad de ADN cultivado con solamente nitrógeno ¹⁵N, mientras que ambas hebras del nuevo ADN serían la banda mas liviana ¹⁴N. Sin embargo, si cualquiera de los modelos de la replicación de ADN, el semi conservativo o dispersivo están correctos, el ADN de doble hebra dentro de una bacteria después de una generación sería una mezcla de ADN nuevo y ADN viejo y por ende, una hebra estaría compuesta de ¹⁵N y una hebra estaría compuesta de de ¹⁴N. Por ende, este ADN "hibrido" podría ser una densidad intermedia entre bandas ADN de ¹⁵N ¹⁴N. En la figura 4 a continuación, se puede ver lo que predicen los tres modelos de replicación de ADN que va a suceder en el experimento de Meselson y Stahl, seguido por lo que observan en realidad.

Como se puede ver de los resultados arriba, después de una generación de división celular, el ADN total de la bacteria creciente tiene una densidad intermedia, como la densidad entre N y ¹⁵N DNA. Esto fuertemente refutó el modelo conservativo de ADN, el cual mantuvo que las dos hebras originales del ADN persistirían y se mantienen ligados a si mismo y una nueva copia de dos hebras de ADN serían sintetizadas. En otras palabras, el modelo conservativo de la replicación de ADN predeciría , después de una generación, la mitad de las moléculas de ADN tendrían solamente ADN ¹⁵N y la otra mitad tendría ADN ¹⁴N, la cual aparecería como dos bandas distintas de densidad de ADN. Pero como es visto aquí, todas las moléculas de ADN eran de densidad intermedia. Sin embargo, los dos modelos restantes, el semi conservativo y el dispersivo, aún eran consistentes con estos resultados. De manera de examinar los dos modelos restantes de la replicación de ADN, debemos examinar generaciones adicionales de crecimiento de bacterial con el isótopo normal de nitrógeno ¹⁴N. En la figura 5 a continuación están las predicciones de los tres modelos de replicación de ADN a través de múltiples generaciones:

Y ahora, aquí están las observaciones de Meselson y Stahl (Figura 6):

Mientras las células bacteriales crecían y se dividían más, Meselson y Stahl observaron de que la banda ADN ¹⁵N desaparecía y una banda de ADN ¹⁴N aparecía y después se ponía progresivamente mas obscura y una banda de densidad intermedia aparecía y persistía en la misma intensidad. Esto descrédito fuertemente el modelo dispersivo de la replicación de ADN, el cual predijo de que solo una banda de ADN existiría y se haría progresivamente menos densa que la cantidad de ADN ¹⁴N el la mezcla dispersiva incrementaba con cada generación. Por ende, en un simple experimento con resultados bien claros, Meselson y Stahl refutaron sólidamente dos de los posibles modelos de replicación de ADN, al mismo tiempo apoyando fuertemente otro posible modelo.

La comunidad científica estaba de acuerdo de que esta evidencia era suficientemente fuerte para apoyar al modelo semi-conservativo. John Cairns, uno de los biólogos moleculares lideres de la era le llamaba, "el experimento mas bonito en la biología". Aun hoy, el experimento de Meselson y Stahl es enseñado alrededor del mundo como un ejemplo bien clásico del método científico moderno de la experimentación. Con un simple diseño, tres hipótesis científicas fueron probadas por la observación y verificación de sus predicciones.

Científicos ahora han detallado el entendimiento de los eventos moleculares de la replicación de ADN (vea nuestro módulo ADN III). Estos eventos moleculares ocurren tal como fue predicho por el modelo de Watson y Crick de la estructura de ADN y verifican de que el modelo semi-conservativo de la replicación de hebras de ADN con isótopos de nitrógeno aún es utilizado por científicos alrededor del mundo mientras continúan a explorar los misterios y complejidades del ADN, el material genético de la vida.